Οι γενετικές ασθένειες εξακολουθούν να αποτελούν παγκόσμια πρόκληση, καθώς προκαλούνται από μεταλλάξεις γονιδίων που επηρεάζουν τις βιολογικές λειτουργίες, τις μεταβολικές διεργασίες ή την παραγωγή ορισμένων απαραίτητων πρωτεϊνών των ατόμων, σε διάφορες κληρονομικές διαταραχές. Τα φάρμακα γονιδιακής θεραπείας είναι ένας τύπος θεραπευτικής παρέμβασης που στοχεύει συγκεκριμένα γονίδια, με στόχο την επιδιόρθωση ή την τροποποίηση τους και παρέχει νέες οδηγίες στα κύτταρα να παράγουν λειτουργικές πρωτεΐνες ή να παρεμβαίνουν στα γονιδιακά ελαττώματα που προκαλούν ασθένειες.
Τα κοινά γονιδιακά φάρμακα περιλαμβάνουν κυρίως DNA και RNA, όπου το DNA μπορεί να είναι θραύσματα γονιδίων ή αλληλουχίες γονιδίων με θεραπευτικά αποτελέσματα. Αυτά τα DNA παραδίδονται στα κύτταρα για να αντικαταστήσουν ή να συμπληρώσουν τις ελαττωματικές ή ελλείπουσες λειτουργίες γονιδίου. Το RNA μπορεί να είναι αγγελιαφόρο RNA (mRNA), μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) ή αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια (ASO), κ.λπ., τα οποία μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την τροποποίηση, την αναστολή της έκφρασης επιβλαβών γονιδίων ή την αποκατάσταση της λειτουργίας συγκεκριμένων γονιδίων.
Ωστόσο, τόσο το DNA όσο και το RNA αντιμετωπίζουν πολλές προκλήσεις από την είσοδο στο ανθρώπινο σώμα έως την επίτευξη των κυττάρων-στόχων. Δεδομένου ότι οι αλληλουχίες γονιδίων είναι ασταθείς στη γαστρεντερική οδό, συνήθως χορηγούνται με ενδοφλέβια ή υποδόρια ένεση, αλλά ακόμα κι έτσι, οι περισσότερες από τις αλληλουχίες γονιδίων εξακολουθούν να αποικοδομούνται από τις άφθονες νουκλεάσες στο ανθρώπινο σώμα.
Όταν μια μικρή ποσότητα υπολειμματικών φαρμάκων γονιδίων φτάσει στο εξωτερικό των κυττάρων-στόχων, δεν μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα επειδή οι αλληλουχίες γονιδίων είναι μεγάλα μόρια με φωσφορικές ομάδες που φέρουν αρνητικά φορτία, ενώ οι κυτταρικές μεμβράνες φέρουν επίσης αρνητικά φορτία. Όταν συναντώνται δύο αρνητικά φορτία, τα γονίδια απωθούνται και δεν μπορούν να εισέλθουν στα κύτταρα. Επομένως, πρέπει να αναπτύξουμε συγκεκριμένες μεθόδους γονιδιακής χορήγησης φαρμάκων για να αποτρέψουμε την αποικοδόμησή τους in vivo και να βελτιώσουμε την αποτελεσματικότητα της διείσδυσης στην κυτταρική μεμβράνη και να παραδώσουμε ομαλά αλληλουχίες DNA ή RNA στα κύτταρα.
Μέθοδοι παράδοσης για γονιδιακά φάρμακα
Οι τρέχουσες κοινές μέθοδοι παράδοσης γονιδίων χωρίζονται κυρίως σε δύο κατηγορίες: παράδοση ιικού φορέα και παράδοση μη-ιικού φορέα. Η παροχή ιικού φορέα περιλαμβάνει κυρίως αδενο-συσχετιζόμενο ιό (AAV) και φακοϊό, κ.λπ., οι οποίοι μπορούν να προσομοιώσουν τη διαδικασία μόλυνσης από τον ιό των κυττάρων-ξενιστών και να διασχίσουν εύκολα κυτταρικούς φραγμούς, επιτυγχάνοντας έτσι υψηλή απόδοση διανομής. Ωστόσο, η παροχή ιικού φορέα έχει επίσης προβλήματα: πρώτον, έχει περιορισμένη χωρητικότητα συσκευασίας, όπως η μέγιστη χωρητικότητα συσκευασίας του AAV είναι 4,7 kb, που δεν μπορεί να παραδώσει μεγαλύτερες αλληλουχίες γονιδίων. Δεύτερον, οι ιικοί φορείς μπορεί να προκαλέσουν σοβαρές ανοσολογικές αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανοσίας και της χυμικής ανοσίας, θέτοντας κινδύνους για κλινικές εφαρμογές. Σε σύγκριση με αυτό, οι μη ιικοί φορείς έχουν τεράστια πλεονεκτήματα όσον αφορά την ασφάλεια και την ικανότητα φόρτωσης φαρμάκων.
Οι τρέχοντες συνήθως χρησιμοποιούμενοι μη-ιικοί φορείς περιλαμβάνουν κυρίως λιποσώματα, πολυμερή, νανοσωματίδια, εξωσώματα κ.λπ., μεταξύ των οποίων τα λιποσώματα είναι κυστίδια που σχηματίζονται από αμφίφιλα μόρια με διαμέτρους που κυμαίνονται από 100nm έως 1um. Αποτελούνται κυρίως από φωσφολιπίδια, χοληστερόλη, λιπίδια PEG και κατιονικά λιπίδια. Η δομή της διπλοστοιβάδας των φωσφολιπιδίων είναι παρόμοια με τις κυτταρικές μεμβράνες και μπορεί να εισέλθει στα κύτταρα ομαλά μέσω της ενδοκυττάρωσης. Επιπλέον, τα λιποσώματα μπορούν επίσης να τροποποιήσουν την PEG ή συγκεκριμένα αντισώματα στις επιφάνειές τους για να ξεφύγουν από την ανοσολογική κάθαρση του σώματος ενώ στοχεύουν συγκεκριμένους ιστούς ή κύτταρα. Τα κατιονικά λιποσώματα είναι λιποσώματα που περιέχουν θετικά φορτισμένα λιπίδια άλατος τεταρτοταγούς αμμωνίου, τα οποία μπορούν να συνδεθούν καλύτερα με αρνητικά φορτισμένα φάρμακα νουκλεϊκών οξέων και να διατηρήσουν τη σταθερότητα του συστήματος χορήγησης. Επομένως, τα λιποσώματα είναι μία από τις κοινές μεθόδους παροχής μη-ιικών φορέων για γονιδιακά φάρμακα.
Ωστόσο, τα παραδοσιακά λιποσώματα έχουν επίσης ορισμένα προβλήματα: πρώτα απ 'όλα, λόγω του μεγάλου εύρους των διαμέτρων των λιποσωμάτων, αν και αυτό μπορεί να εξασφαλίσει επαρκή ικανότητα φόρτωσης φαρμάκου, όταν τα λιποσώματα διέρχονται από το αγγειακό ενδοθηλιακό διάκενο (100-200 nm), το πολύ μεγάλο μέγεθος θα εμποδίσει αυτή τη διαδικασία. Επιπλέον, αφού τα λιποσώματα εισέλθουν στα κύτταρα μέσω ενδοκυττάρωσης και σχηματίσουν σύστημα ενδοσωμάτων-λυσοσώματος, τα παραδοσιακά λιποσώματα δεν μπορούν να ολοκληρώσουν τη λυσοσωμική διαφυγή εγκαίρως, με αποτέλεσμα τα περισσότερα γονιδιακά φάρμακα να αποικοδομούνται από τα λυσοσώματα και να μην μπορούν να ασκήσουν τα αποτελέσματά τους. Με βάση αυτές τις ελλείψεις των παραδοσιακών λιποσωμάτων στην παροχή γονιδιακών φαρμάκων, τα λιπιδικά νανοσωματίδια (LNP) έχουν αναπτυχθεί και έχουν γίνει μια σημαντική μέθοδος χορήγησης, ιδιαίτερα κατάλληλη για την παροχή νουκλεϊκών οξέων σε κύτταρα και ιστούς στόχους.
Εισαγωγή στο σύστημα μεταφοράς LNP
Τα νανοσωματίδια λιπιδίων (LNP) είναι νανοσωματίδια που αποτελούνται από ουσίες που μοιάζουν με λιπίδια- και έχουν διάμετρο γενικά μεταξύ 10-200 nm. Σε σύγκριση με τα παραδοσιακά λιποσώματα, είναι μικρότερα και ευκολότερα περνούν μέσα από αγγειακά ενδοθηλιακά κενά. Επιπλέον, το LNP αποτελείται συνήθως από κατιονικά/ιονίσιμα λιπίδια, βοηθητικά φωσφολιπίδια, λιπίδια πολυαιθυλενογλυκόλης (PEG) και χοληστερόλη. Μεταξύ αυτών, τα βοηθητικά φωσφολιπίδια και η χοληστερόλη μπορούν να αυξήσουν τη σταθερότητα του LNP. Τα λιπίδια PEG βοηθούν στην αύξηση του χρόνου κυκλοφορίας του LNP in vivo και στη μείωση των ανοσολογικών αντιδράσεων. Αυτά τα συστατικά έχουν παρόμοιες λειτουργίες με τα παραδοσιακά λιποσώματα. Η διαφορά έγκειται στα κατιονικά/ιονίσιμα λιπίδια, τα οποία είναι επίσης ο κύριος τομέας προστασίας διπλωμάτων ευρεσιτεχνίας για το LNP.
Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, τα κατιονικά λιποσώματα μπορούν να διατηρήσουν αποτελεσματικά τη δέσμευση με φάρμακα νουκλεϊκού οξέος και να βελτιώσουν την αποτελεσματικότητα χορήγησης φαρμάκων νουκλεϊκού οξέος. Ωστόσο, τα κατιονικά λιποσώματα είναι επίσης επιρρεπή σε μη-ειδική δέσμευση με αρνητικά φορτισμένες πρωτεΐνες πλάσματος, κύτταρα αίματος κ.λπ. στην κυκλοφορία του σώματος, προκαλώντας συσσώρευση λιποσωμάτων και απομάκρυνση γρήγορα από το σώμα (η μισή-ζωή των κατιονικών λιποσωμάτων in vivo είναι μόνο 15 λεπτά).
Για να λύσουν αυτό το πρόβλημα, οι ερευνητές ανέπτυξαν έναν νέο τύπο λιπιδικού υλικού που ονομάζεται ιονίσιμα λιπίδια. Τα ιονίσιμα λιπίδια είναι πολύ παρόμοια με τα κατιονικά λιπίδια στη δομή. Λαμβάνοντας ως παραδείγματα το κοινό κατιονικό λιπίδιο DOTAP και το ιονιζόμενο λιπίδιο DODAP, η διαφορά είναι ότι το DOTAP είναι ένα άλας τεταρτοταγούς αμμωνίου με θετικό φορτίο, ενώ το DODAP είναι μια δομή τριτοταγούς αμίνης. Η δομή τριτοταγούς αμίνης μπορεί να διατηρήσει το pKa του λιπιδίου μεταξύ 6-7. Όταν το pH είναι χαμηλότερο από το pKa (υπό όξινες συνθήκες), τα ιονίσιμα λιπίδια είναι θετικά φορτισμένα.
Όταν το pH είναι κοντά στο pKa (υπό ουδέτερες συνθήκες), τα ιονίσιμα λιπίδια είναι ουδέτερα. Αυτός ο σχεδιασμός μπορεί να λύσει έξυπνα το πρόβλημα που αντιμετωπίζουν τα κατιονικά λιποσώματα: δεδομένου ότι το pH στην κυκλοφορία του αίματος είναι κοντά στο ουδέτερο, τα ιονίσιμα λιπίδια είναι επίσης ουδέτερα και η μη ειδική δέσμευση μεταξύ αυτών και των πρωτεϊνών του πλάσματος ή των κυττάρων του αίματος μειώνεται σημαντικά, παρατείνοντας τον χρόνο ημιζωής. Επιπλέον, όταν το ιονιζόμενο λιπίδιο LNP προσλαμβάνεται από τα κύτταρα και εισέρχεται στα λυσοσώματα, τα λιπίδια ιονίζονται και φορτίζονται θετικά στο λυσοσωμικό περιβάλλον με pH 5-6. Τα θετικά φορτισμένα λιπίδια συντήκονται εύκολα με τη μεμβράνη ενδοσώματος-λυσοσώματος, επιτρέποντας στα λιποσώματα να διαφύγουν στο κυτταρόπλασμα, να διαχωρίσουν και να απελευθερώσουν νουκλεϊκά οξέα, ασκώντας έτσι τα αποτελέσματά τους. Συνοπτικά, ο σχεδιασμός του συστήματος φορέα LNP περιλαμβάνει τη βελτιστοποίηση της λιπιδικής σύνθεσης, του μεγέθους των σωματιδίων, του επιφανειακού φορτίου και της σταθερότητας για την επίτευξη αποτελεσματικής παράδοσης γονιδίων.
Στρατηγική Βιοανάλυσης LCMS για Συσκευασμένα γονιδιακά φάρμακα LNP-
Τα συσκευασμένα γονιδιακά φάρμακα-LNP αποτελούνται κυρίως από το κέλυφος του LNP και το ίδιο το γονιδιακό φάρμακο. Το κέλυφος LNP αποτελείται κυρίως από λιπιδικά συστατικά (τα κατιονικά/ιονιζόμενα λιπίδια αντιπροσωπεύουν περίπου το 30-50%, τα λιπίδια PEG αντιπροσωπεύουν περίπου το 2%, η χοληστερόλη αντιστοιχεί περίπου στο 20-50%, τα βοηθητικά φωσφολιπίδια αντιστοιχούν σε περίπου 10-20%), ενώ τα γονιδιακά φάρμακα αποτελούνται κυρίως από θραύσματα SO.D. Σύμφωνα με τους πιο πρόσφατους κανονισμούς του NMPA και του FDA[14-15], για την εφαρμογή IND φαρμάκων συστήματος χορήγησης φαρμάκων όπως το LNP, εκτός από τη διεξαγωγή φαρμακολογικών και φαρμακοκινητικών μελετών σχετικά με το δραστικό συστατικό (αλληλουχία γονιδίων), απαιτείται επίσης η ασφάλεια και η φαρμακευτική αξιολόγηση για νέα συστατικά λιπιδίων που δεν έχουν χρησιμοποιηθεί σε συστήματα διανομής φαρμάκων, όπως τα φάρμακα που κυκλοφορούν στο εμπόριο. λιπίδια με ειδικές τροποποιήσεις στο LNP.
Η βιοανάλυση LCMS των λιπιδίων LNP επικεντρώνεται σε κατιονικά/ιονίσιμα λιπίδια και λιπίδια PEG. Λόγω των δομικών διαφορών μεταξύ τους, το κατιονικό/ιονιζόμενο μοριακό βάρος λιπιδίου είναι γενικά εντός 1 kDa, ενώ το μοριακό βάρος λιπιδίου PEG μπορεί να φτάσει τα 2~5 kDa μετά τη μεταφορά ομάδων τροποποίησης, με αποτέλεσμα μεγάλες διαφορές στη χρωματογραφική κατακράτηση και την απόκριση φασματομετρίας μάζας μεταξύ τους. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η περιεκτικότητα σε κατιονικό/ιονιζόμενο λιπίδιο στο LNP είναι υψηλότερη από εκείνη του λιπιδίου PEG, η διαφορά απόκρισης οδηγεί στην αδυναμία αποτελεσματικής ενοποίησης των μεθόδων προεπεξεργασίας (επιλογή διαλύτη εκχύλισης, προσδιορισμός παράγοντα αραίωσης) και των δύο. Επιπλέον, λόγω της παρουσίας πολλών αιχμών παρεμβολής γύρω από τη θέση κορυφής του λιπιδίου PEG, απαιτείται συχνά μεγαλύτερη βαθμίδα διαχωρισμού υγρής φάσης για αποτελεσματικό διαχωρισμό, κάτι που δεν μπορεί να εγγυηθεί υψηλή απόδοση ανάλυσης. Ως εκ τούτου, καθιερώνουμε ξεχωριστά τη μέθοδο ανίχνευσης λιπιδίων PEG στη βιοανάλυση. Ταυτόχρονα, το κατιονικό/ιονιζόμενο λιπίδιο και το λιπίδιο PEG έχουν επίσης κοινές δυσκολίες στην ανάπτυξη της μεθόδου λόγω των λιπιδικών συστατικών τους, όπως κακή διαλυτότητα στο νερό, αστάθεια στη βιολογική μήτρα, σύνδεση πρωτεΐνης στην ανάκτηση που υπερβαίνει το όριο, υψηλή παρεμβολή και υπόλειμμα λιπιδίου PEG, αλλαγή σταθερότητας λιπιδίου σε πραγματικό εσωτερικό πρότυπο επιλογής δείγματος.
